Pro správné měření je potřeba provádět kalibraci jednotlivých částí mikroskopu. Kalibraci vyžadují nejvíce skener a nosník. U skeneru dochází časem k depolarizaci jednotlivých zrn, u nosníku se mění parametry hrotu během používání a jednotlivé nosníky se od sebe dost liší.
se dá provádět pomocí standardů uměle vyrobených (zpravidla technologií z výroby polovodičů, popř. nanočástice) nebo přirozených, a konkrétní provedení závisí na velikosti rozsahu. Při kalibraci skeneru je nutno rozlišit laterální a vertikální směr. Kalibrace laterálního směru se dá provádět pomocí kuliček definovaného poloměru†, které naneseme na podklad tak, aby vytvořily jednovrstvé těsné hexagonální uspořádání. Na získaném obrazu pak můžeme určit jak lineární zkreslení (známe-li poloměr koulí), tak nelinearity skeneru z deformovaného obrazu hexagonální mříže. Pro přesnější kalibraci je však vhodnější použít nějakou mříž, např. soustavu vyleptaných čtverců v křemíkovém povrchu, která je dostatečně pevná a stála, abychom mohli srovnávat jednotlivá měření. Ke kalibraci lze využít některé přirozené vzorky i biologického původu, např. virus tabákové mozaiky má poměrně stálou velikost. Pro měření na atomární úrovni lze použít i čerstvě připravenou monokrystalickou vrstvu o známé mřížkové periodě (např. rekonstrukce křemíku).
Ve vertikálním směru lze ke kalibraci malých výšek použít terasy na monokrystalických plochách (MgO, NaCl), které mají zpravidla výšku jedné či dvou mezirovinných vzdáleností, přímo atomární povrch lze využít spíše k testování citlivosti přístroje nebo šumu. Pro větší výšky lze použít umělé standardy (leptané vzorky) nebo interferometrické metody.
Pro kvantitativní AFM měření potřebujeme kalibrovat také detektor ohybu, tj. nalézt převodní koeficienty cn a cl, které převádí proud na výchylku. Při mapování povrchu potřebujeme pouze ověřit linearitu detektoru v rozsazích ohybu 0,1 nm při využití zpětné vazby a až 103 nm v režimu konstantní výšky či při spektroskopii. Ověření se provádí „vtlačováním“ hrotu do tvrdého a rovného povrchu (např. MgO), výsledná F–d křivka by měla mít konstantní sklon. Tento sklon udává parametr cn v případě, že svazek laseru dopadá do místa uchycení hrotu, jinak je nutno provést korekci ve tvaru cn0=cn(Δl±l)/l, kde l je délka nosníku a Δl je posunutí místa dopadu svazku vzhledem k hrotu. Laterální parametr cl by měl být u symetrického detektoru shodný s cn, ale v realitě se liší vlivem nesymetrie svazku a různé šířka a délky nosníku. Proto je nutno jej kalibrovat samostatně, a to pomocí statického tření. Kalibrace je však obtížnější, protože laterální tuhost nosníku je větší než normálová a více deformuje výsledky.
Poznámka: Výsledky kalibrace by měly být určeny z několika nezávislých měření za použití statistických metod. Při kalibraci skeneru je nutno měřit standard při největším rozlišení, které mikroskop umožňuje. Získané hodnoty platí však jen pro jeden skenovací rozsah a mohou také záviset na rychlosti skenování. Záleží na software mikroskopu, zda lze získané koeficienty aplikovat přímo při sběru dat (někdy jen pro lineární zkreslení) a nezávisle pro jednotlivé rozsahy.
† Takové vzorky se prodávají jako standardy do velikosti asi 20 nm, nejčastěji se jedná o latexové kuličky.